El pino piñonero (Pinus pinea) se caracteriza por una baja diferenciación de los parámetros de crecimiento, una alta plasticidad fenotípica y una baja variabilidad genética; por ello, detectar la diversidad en poblaciones chilenas introducidas es relevante para los programas de conservación y mejoramiento genético. En este estudio se exploró la variabilidad entre poblaciones exóticas de pino piñonero en Chile utilizando un análisis proteómico basado en electroforesis de piñones. Se muestrearon y cosecharon piñas de 30 poblaciones distribuidas a lo largo de un gradiente climático en Chile, y las proteínas se extrajeron de la harina de las semillas utilizando el protocolo de precipitación de acetona TCA. Los extractos se sometieron a SDS-PAGE y 2-DE para la resolución de proteínas, se capturaron imágenes de gel y se cuantificó la intensidad de spots (manchas) o bandas, y se sometieron a un análisis estadístico (ANOVA, agrupación de análisis jerárquico no supervisado y regresión PLS). El rendimiento proteico varió entre poblaciones desde 161,7 mg/g de peso seco (poblaciones del norte) a 298,7 (poblaciones del sur). Un total de 50 bandas se identificaron mediante SDS-PAGE en el rango de 6,5–200kDa Mr., de las cuales 17 mostraron diferencias cuantitativas o cualitativas, con 12 proteínas identificadas. Los extractos de piñones de las poblaciones más distantes se analizaron mediante 2-DE, observándose 129 puntos diferenciales, de los cuales 13 se propusieron como supuestos marcadores proteicos de variabilidad. De los 129 puntos, se identificaron 118 proteínas después del análisis MALDI-TOF/TOF. Las proteínas identificadas se clasificaron en dos categorías principales: relacionadas con la reserva y con el estrés. Presentamos el primer mapa de proteínas de piñones de P. pinea. El uso de un enfoque proteómico fue útil para detectar variabilidad del pino piñonero a lo largo de tres macrozonas chilenas, con correlaciones entre los perfiles de proteínas y parámetros geoclimáticos, lo que sugiere un nuevo enfoque para estudiar la variabilidad de esta especie. Significatividad: Este estudio presenta el primer mapa de proteínas de piñones de pino piñonero, relevante para el avance de la caracterización de proteínas en piñones. Se proponen marcadores putativos de proteínas que evidencian que un enfoque proteómico puede ser útil para detectar variabilidad del pino piñonero entre macrozonas chilenas, lo que sugiere un nuevo enfoque para estudiar la variabilidad de esta especie, que también puede extrapolarse a otras especies forestales frutales.